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實(shí)驗(yàn)原理：做ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí)如何操作?
ELISA實(shí)驗(yàn)原理是酶分子與抗體或抗抗體分子共價(jià)結(jié)合，此種結(jié)合不會(huì)改變抗體的免疫學(xué)特性，也不影響酶的生物學(xué)活性。
酶標(biāo)記抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合。滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氫體由無色的還原型變成有色氧化型，出現(xiàn)顏色反應(yīng)。
因此，可通過底物的顏色反應(yīng)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，顏色反應(yīng)的深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比。此種顯色反應(yīng)可通過ELISA檢測(cè)儀進(jìn)行定量測(cè)定，這樣就將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體反應(yīng)的特異性結(jié)合起來，使ELISA方法成為一種既特異又敏感的檢測(cè)方法。
ELISA實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng):
1、固相載體選擇
聚苯乙x：具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。
聚氯乙x：聚氯乙x對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙x高，但空白值也略高。
良好的ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間性能相近。
2、包被
①板孔的選擇：ELISA別的微孔板。
②抗體選擇：選擇支持ELISA實(shí)驗(yàn)的抗體，根據(jù)推薦濃度稀釋或摸索適濃度。
③包被緩沖液：pH9.6碳酸鹽緩沖液或pH7.2磷酸鹽緩沖液。
④包被溫度：2-8 ℃過夜包被或室溫(37℃)包被2h。
⑤包被濃度：包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化。一般包被濃度為10ug/ml-20ug/ml。
3、封閉
①包被之后一定要立即封閉(封閉非特異性抗體)。
②選擇效果較好的封閉劑(細(xì)胞培養(yǎng)BSA、Tween等)。
4、加樣及孵育
①加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
②孵育的時(shí)間及溫度參考試劑盒說明書。如有條件，建議加樣孵育時(shí)使用shaker震蕩儀，推薦軌道直徑3mm，轉(zhuǎn)速在500±50rpm。
③檢測(cè)抗體、酶標(biāo)物的稀釋比例、孵育溫度、孵育時(shí)間嚴(yán)格根據(jù)說明書提示。
④洗板對(duì)于ELISA來說，是其關(guān)鍵的一步，保證ELISA的特異性。
⑤封板膜一定要一次一換，切勿二次甚至多次使用，以防交叉污染。
5、顯色和終止
①使用需檢查，底物在加入96孔板之應(yīng)為無色透明。
②顯色底物需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免污染。
③孵育時(shí)間，說明書上為參考范圍，具體需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件自行摸索。可參考標(biāo)曲濃度大孔的顏色，變?yōu)樗{(lán)色較明顯時(shí)即可。
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